汪峰，副教授，华中科技大学同医院检验科，作者近年来一直从事结核病诊断相关的检验工作及实验研究。
年3月24日是第25个世界防治结核病日，今年我国的宣传主题是：携手抗疫防痨，守护健康呼吸。这个主题寓意当前新冠肺炎疫情形势不断好转的情况下，另一种通过飞沫传播的慢性呼吸道传染病---肺结核，也是当前严重危害人民健康的重要传染病，防治工作时不我待[1]。据WHO估计，全球约17亿人存在结核分枝杆菌感染[2]。结核分枝杆菌（MycobacteriumTuberculosis，MTB）感染人体后，主要存在两种状态：活动性结核病（ActiveTBDisease）和潜伏结核感染（LatentTBInfection，LTBI）。LTBI在人体免疫功能低下或被抑制的状态下易进展为活动性结核病。近年来，γ干扰素释放试验（IGRAs）被广泛用于活动性结核病的辅助诊断和LTBI筛查[3,4]。该方法采用结核特异抗原ESAT-6和CFP-10进行体外诱导，由于使用的诱导抗原和卡介苗及非结核分枝杆菌没有交叉成分，所以该检测不受BCG疫苗接种影响，其特异性明显优于结核菌素试验。目前IGRAs试验主要有2类：酶联免疫斑点技术（ELISPOT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISPOT技术的代表方法为T-SPOT.TB（简称T-SPOT），ELISA的代表方法为QuantiFERON-TBGold（简称QFT），均已被写入中国多个学科的专家共识[4-13]。▎T-SPOT相关指南：
虽然自年在中国拿到注册证之后，IGRAs医院医院进行广泛应用。但现实是，IGRAs以及其代表方法T-SPOT在临床应用中存在很多问题，笔者简单列举如下：
部分医生不清楚ELISPOT和ELISA两种技术的区别，医院检验报告单也没有进行标注，将其统称为结核感染T细胞检测。实际上，两种技术区别很大，T-SPOT的缺点为需要提取外周血单个核细胞（PBMC），操作相对繁琐，对实验室人员、场地和设备具有一定要求。但检测过程对PBMC进行标准化，其定量结果更有参考价值，受免疫抑制影响也较少，所以敏感性较高。QFT采用全血进行试验，操作相对简单，国内也有很多全自动仪器可以进一步减少人工操作。但不同个体外周血淋巴细胞数目差别大，其定量结果意义较小，在免疫抑制情况下出现不确定结果比例高。由于没有清洗过程，在某些如自身免疫病患者血液中已存在的IFN-γ会造成空白对照背景高，导致出现不确定结果。综合两种技术优缺点，笔者认为T-SPOT除了用于潜伏性结核筛查之外，还可用于辅助结核病诊断，而QFT更适合用于潜伏性结核筛查。T-SPOT技术操作标准化是未来亟待解决的问题
T-SPOT操作相对繁琐，试验过程涉及PBMC分离、清洗、细胞计数、细胞诱导、以及第二天的酶联免疫斑点法检测所有被捕获的IFN-γ。理论上，一个斑点代表一个结核特异性抗原诱导下分泌IFN-γ的细胞。QFT操作相对简单，试验过程仅涉及全血细胞诱导及第二天使用酶联免疫法检测培养液上清中分泌的IFN-γ水平。
T-SPOT操作过程中多个步骤可影响结果，例如：PBMC计数不准确或不计数，将使检验结果完全不可信。理论上，由于PBMC计数不准确加入两倍细胞，其定量斑点值结果也会增加两倍。底物显色时间也会明显影响实验结果。底物显色时间明显延长后可使部分小斑点变成肉眼可见的大斑点，造成假阳性结果。另外，显色时间延长也会使临近斑点融合成一片，导致斑点计数仪计数不准确。斑点计数仪参数设置不同以及不同厂家斑点计数仪会导致相同板条出现不一致的结果。对于斑点计数仪参数设置，笔者认为最重要的两个参数为曝光时间和斑点读取灵敏度。T-SPOT至今无有效的室内质控方法。笔者建立了一种基于阳性对照PHA均值绘制L-J质控曲线的方法，有机会以后跟大家详细介绍。以上可以看出，要想在不同实验室得到统一的T-SPOT实验室结果，道路仍很漫长。
T-SPOT结果解释
对于此点，笔者反复强调，保证结果的准确性是进行结果解读的前提。国内有专家提出，T-SPOT结果跟临床不符合是常有的事，如有时T-SPOT结果大于，但病人没有任何相关的结核病临床表现。本人完全认同有这样的情况出现，但请大家一定去看一看你们的实验室具体是怎么做的，是否在某些关键步骤存在问题。T-SPOT阳性提示体内存在结核分枝杆菌感染，反之则为不存在结核分枝杆菌感染。由于T-SPOT敏感性较高，其阴性用于排除结核感染意义较高。对于阳性结果，不管是T-SPOT还是QFT，只说明患者存在结核感染，均不能用于区分活动和潜伏状态。理论上，活动性结核患者体内存在更多的抗原特异性淋巴细胞，所以活动性结核患者T-SPOT值会高于潜伏性结核。该理论实际上是成立的，但由于不同个体的免疫功能差异对结果造成影响，在实际情况下利用斑点值结果区分活动和潜伏性能较差。例如，活动性结核患者伴随明显免疫抑制状态时，抗原孔值会明显降低，常常出现二三十个斑点，导致无法和潜伏性结核相鉴别。如果患者不存在免疫抑制状态，T-SPOT结果为高值，例如大于个斑点，常常提示活动性结核。反之，当T-SPOT斑点值低于50时，常提示潜伏性结核感染。T-SPOT试验中CFP-10抗原出现高值的情况比ESAT-6更常见。QFT试验定量结果意义可参考T-SPOT。鉴于T-SPOT检测无法区分活动与潜伏性结核，从而极大限制该法在结核高负担国家中的应用，笔者今天重点跟大家介绍一种TBAg/PHA比值法，该法可以提高T-SPOT结果用于诊断活动性结核的特异性。TBAg/PHA比值法的定义为，使用T-SPOT试验中结核特异性斑点值（单个患者ESAT-6和CFP-10中的较大者为TBAg）比上阳性对照植物血凝素（PHA）斑点值。该比值可以区分活动和潜伏性结核的理论基础为，当活动性结核患者存在免疫抑制情况时，其TBAg值会降低，但PHA孔正好可反映患者免疫状态，也会相应降低，所以此时TBAg/PHA仍为高值。反之，当潜伏性结核患者免疫功能较强时，TBAg会相应增高，而PHA在这种情况下也会相应增高，所以此时TBAg/PHA仍为低值（原理如图1）。因此，使用TBAg/PHA比值法优于单独使用TBAg抗原孔数值，在区分活动与潜伏性结核感染时特异性更高。图1：TBAg/PHA作用原理，可以消除不同个体之间存在的免疫功能异质性对T-SPOT斑点值的影响。LTBI，潜伏性结核感染；TB，活动性结核病。
使用TBAg/PHA比值区分活动与潜伏性结核的性能图2
使用TBAg/PHA区分活动性结核与LTBI的敏感性和特异性达到80%和90%以上。ROC曲线下面积为0.[14]。（图2）
TBAg/PHA比值在免疫功能低下人群中的应用图3
尤其是在免疫功能低下人群，此时ESAT-6和CFP-10在活动和潜伏性结核中基本无差异，但我们发现PHA在ATB患者伴随免疫抑制状态时明显降低，所以TBAg/PHA在此情况下表现依然较好。AUC曲线下面积为0.[15]。（图3）TBAg/PHA比值在肺外结核诊断中的应用[16]（图4）图4
治疗监测图5
虽然抗结核治疗之后ESAT-6和CFP-10抗原孔均值会逐渐降低，但由于不同个体异质性大，结果没有统计学差异。TBAg/PHA比值抗结核治疗之后结果也显著降低，结果具有统计学差异[16]。（图5）除此之外，TBAg/PHA比值在结核诊断的其他方面，如肺结核球与肺癌的鉴别诊断[17]、结核性脑膜炎的早期诊断[18]、肠结核和克罗恩病的鉴别诊断[19]等方面均具有一定的应用价值。且TBAg/PHA医院也进行过验证[20]。最近，笔者实验室通过前瞻性队列研究证实，联合XpertMTB/RIF检测和TBAg/PHA比值法，在快速诊断活动性结核病时，性能进一步提升，预示结合这两种方法是一种可满足需求的可快速诊断活动性结核病的实验室流程。相信随着T-SPOT试验标准化进程的推进，TBAg/PHA比值在临床应用中的作用会逐渐被人们重视，该方法可能会成为结核高负担国家辅助诊断结核病的重要方法。参考文献：
[1]中国疾控中心结核病防控中心官方